УДК 616.155.13: 612.127.4 - В. В. Аничкин (Гомель) А. Н. Лызиков (Гомель) > М. Е. Абраменко (Гомель) Х. Х. Лавинский...

УДК 616.155.13: 612.127.4
^ Особенности пойкилоцитоза,

вызванного действием активных форм азота

М.Н. Стародубцева, Т.Г. Кузнецова, Т.А. Кузнецова,

Дж.К. Эллори, С.Н. Черенкевич, С.О. Абетковская

^ Гомельский муниципальный мед институт

Институт тепло-массообмена НАН Беларуси им УДК 616.155.13: 612.127.4 - В. В. Аничкин (Гомель) А. Н. Лызиков (Гомель) > М. Е. Абраменко (Гомель) Х. Х. Лавинский.... А.В. Лыкова

Оксфордский институт

Белорусский муниципальный институт

В работе способами световой, электрической сканирующей и атомно-силовой микроскопии были исследованы изменение формы, структуры и механических параметров мембраны эритроцита после обработки цельной людской крови пероксинитритом. Установлено УДК 616.155.13: 612.127.4 - В. В. Аничкин (Гомель) А. Н. Лызиков (Гомель) > М. Е. Абраменко (Гомель) Х. Х. Лавинский..., что первичными механизмами конфигурации формы эритроцита (акантоцитоз и сфероцитоз) при действии активных форм азота являются фазовое разделение липидов, связанное с перекисным окислением липидов, и агрегация спектрина.

^ Ключевики: пероксинитрит, пойкилоцитоз, акантоцит, мембранные домены

peculiarities УДК 616.155.13: 612.127.4 - В. В. Аничкин (Гомель) А. Н. Лызиков (Гомель) > М. Е. Абраменко (Гомель) Х. Х. Лавинский... of poikilocytosis induced

by reactive nitrogen species action

M.N. Starodubtseva, T.G. Kuznetsova, T.A. Kuznetsova,

J.C. Ellory, S.N. Cherenkevich, S.O. Abetkovskaya

Gomel State Medical University

Institute Heat-and-mass УДК 616.155.13: 612.127.4 - В. В. Аничкин (Гомель) А. Н. Лызиков (Гомель) > М. Е. Абраменко (Гомель) Х. Х. Лавинский... Transfer of NAS of Belarus of a name A.V. Likov

Oxonian University

Belarussian State Medical University

The changes in a shape, a structure and mechanical properties of erythrocyte membrane after the treatment of whole human blood with УДК 616.155.13: 612.127.4 - В. В. Аничкин (Гомель) А. Н. Лызиков (Гомель) > М. Е. Абраменко (Гомель) Х. Х. Лавинский... peroxynitrite were studied by the methods of light, electron scanning and atomic force microscopy. The primary mechanisms of the changes in erythrocyte shape (acanthocytosis and spherocytosis) at the action of УДК 616.155.13: 612.127.4 - В. В. Аничкин (Гомель) А. Н. Лызиков (Гомель) > М. Е. Абраменко (Гомель) Х. Х. Лавинский... reactive nitrogen species state to be lipid phase separation as a result of lipid peroxidation and spectrin aggregation.

^ Key words: peroxynitrite, poikilocytosis, acanthocyte, membrane domains.



Введение

Активные формы азота могут участвовать как в физиологических УДК 616.155.13: 612.127.4 - В. В. Аничкин (Гомель) А. Н. Лызиков (Гомель) > М. Е. Абраменко (Гомель) Х. Х. Лавинский..., так и патологических процессах в организме [9, 12]. Такие активные формы азота, как пероксинитрит и диоксид азота, в главном, участвуют в развитии патологических состояний человеческого организма [2, 6, 8]. Активные формы азота реагируют с белками и липидами мембраны УДК 616.155.13: 612.127.4 - В. В. Аничкин (Гомель) А. Н. Лызиков (Гомель) > М. Е. Абраменко (Гомель) Х. Х. Лавинский... эритроцита, изменяя ее механические и транспортные характеристики, также форму клеточки [7, 10, 13, 14]. Нередко нереально выделить роль определенной активной формы азота в этих процессах, потому что в реакциях активных форм 1-го типа с УДК 616.155.13: 612.127.4 - В. В. Аничкин (Гомель) А. Н. Лызиков (Гомель) > М. Е. Абраменко (Гомель) Х. Х. Лавинский... другими молекулами образуются новые типы активных форм азота. Так, при действии пероксинитрита на белки сразу находятся несколько активных форм азота: HOONO, ONOO-, ONOOCO2-, NO2 [1, 12].

Пойкилоцитоз является соответствующей чертой ряда болезней (диабет, нервно-дегенеративные УДК 616.155.13: 612.127.4 - В. В. Аничкин (Гомель) А. Н. Лызиков (Гомель) > М. Е. Абраменко (Гомель) Х. Х. Лавинский... заболевания), в числе главных причин развития которых именуют активные формы азота [3, 4, 5].

Цель работы — установление форм эритроцитов цельной крови после ее обработки пероксинитритом, также устройств, ответственных за пероксинитрит-индуцированный пойкилоцитоз.

Материалы и УДК 616.155.13: 612.127.4 - В. В. Аничкин (Гомель) А. Н. Лызиков (Гомель) > М. Е. Абраменко (Гомель) Х. Х. Лавинский... способы

Пероксинитрит получали в реакции NaNO2 и H2O2 в кислых аква смесях с следующим резвым их защелачиванием [15]. В работе использовали NaNO2, NaH2PO4, Na2HPO4 производства «Реахим» (Наша родина, ч.д.а.). Другие УДК 616.155.13: 612.127.4 - В. В. Аничкин (Гомель) А. Н. Лызиков (Гомель) > М. Е. Абраменко (Гомель) Х. Х. Лавинский... реактивы (х. ч.) были производства Рф и Беларуси. Излишек H2O2 в смесях пероксинитрита удаляли фильтрацией раствора через гранулированный MnO2. Пероксинитрит добавляли в кровь здоровых добровольцев (1 мл) в виде капли УДК 616.155.13: 612.127.4 - В. В. Аничкин (Гомель) А. Н. Лызиков (Гомель) > М. Е. Абраменко (Гомель) Х. Х. Лавинский... объемом 5 µл при неизменном смешивании при комнатной температуре (бывалые эталоны). За контроль брали эталоны крови, которые не обрабатывали пероксинитритом. Степень развития окислительного стресса в опытнейших образчиках контролировали по степени окисления внутриэритроцитарного гемоглобина. Эритроциты подвергали хим УДК 616.155.13: 612.127.4 - В. В. Аничкин (Гомель) А. Н. Лызиков (Гомель) > М. Е. Абраменко (Гомель) Х. Х. Лавинский... фиксации 1% веществом глютарового альдегида, после этого отмывали в 3-х сменах фосфатного буфера, а потом — в 3-х сменах дистиллированной воды. Взвесь эритроцитов наносили на стеклянную подложку для предстоящего их исследования при УДК 616.155.13: 612.127.4 - В. В. Аничкин (Гомель) А. Н. Лызиков (Гомель) > М. Е. Абраменко (Гомель) Х. Х. Лавинский... помощи световой, электрической сканирующей и атомно-силовой микроскопии. Световая микроскопия и анализ приобретенных изображений был выполнен с внедрением светового микроскопа «Olympus» с повышением 800 и аппаратно - программного комплекса «Хромосома 1». Сканирующая электрическая микроскопия была выполнена УДК 616.155.13: 612.127.4 - В. В. Аничкин (Гомель) А. Н. Лызиков (Гомель) > М. Е. Абраменко (Гомель) Х. Х. Лавинский... на напыленных образчиках на приборе «Cam Scan» (Oxford Instruments, Великобритания).

^ Атомно-силовая микроскопия. Исследования проводили при помощи атомно-силового микроскопа (АСМ) НТ-206 (ОДО «Микротестмашины», Беларусь). Был избран контактный режим сканирования. Использовались стандартные зонды УДК 616.155.13: 612.127.4 - В. В. Аничкин (Гомель) А. Н. Лызиков (Гомель) > М. Е. Абраменко (Гомель) Х. Х. Лавинский... NSC11 (Micromash Co., Наша родина). В данном режиме регистрировали изображения топографии, угла кручения и отличия консоли АСМ. Изображения угла кручения интерпретировались как карта неоднородности механических параметров и состава объекта на участке УДК 616.155.13: 612.127.4 - В. В. Аничкин (Гомель) А. Н. Лызиков (Гомель) > М. Е. Абраменко (Гомель) Х. Х. Лавинский... сканирования. Исследования проводили сначало на участках 2525 мкм, где выбирались дискоциты, а потом на участках их поверхности размером 55 мкм. Расчет модуля Юнга проводили по стандартной методике ОДО «Микротестмашины», Беларусь. Анализировали 8÷16 изображений пространственного рассредотачивания угла УДК 616.155.13: 612.127.4 - В. В. Аничкин (Гомель) А. Н. Лызиков (Гомель) > М. Е. Абраменко (Гомель) Х. Х. Лавинский... кручения зонда микроскопа для образцов каждого типа (16 мкм2).

Статистическую обработку экспериментальных данных проводили по стандартным методикам программки Excel (n=38,  = 0.05). Результаты статистического анализа представлены в виде границ доверительного интервала с доверительной вероятностью УДК 616.155.13: 612.127.4 - В. В. Аничкин (Гомель) А. Н. Лызиков (Гомель) > М. Е. Абраменко (Гомель) Х. Х. Лавинский... 0,95. Сопоставление средних выборочных проводили с внедрением аспекта Стьюдента.

Результаты и их обсуждение.

Морфология эритроцитов при обработке цельной крови пероксинитритом

Введение пероксинитрита в цельную кровь вызывает морфологические конфигурации эритроцитов. В крови, обработанной пероксинитритом, находятся УДК 616.155.13: 612.127.4 - В. В. Аничкин (Гомель) А. Н. Лызиков (Гомель) > М. Е. Абраменко (Гомель) Х. Х. Лавинский... эритроциты в форме спущенного мяча, акантоциты, эхиноциты, овалоциты и сфероциты. Малая концентрация пероксинитрита, при которой наблюдается пойкилоцитоз, меняется от донора к донору и примерно равна 300 µМ. При этих концентрациях внутриклеточный УДК 616.155.13: 612.127.4 - В. В. Аничкин (Гомель) А. Н. Лызиков (Гомель) > М. Е. Абраменко (Гомель) Х. Х. Лавинский... гемоглобин уже отчасти перебегает в мет-форму, что показывает на развитие окислительного стресса в клеточке. Изменение формы эритроцита начинается с возникновения 1-го либо нескольких выпячиваний на поверхности дискоцита (рис. 1, а и б). С повышением концентрации УДК 616.155.13: 612.127.4 - В. В. Аничкин (Гомель) А. Н. Лызиков (Гомель) > М. Е. Абраменко (Гомель) Х. Х. Лавинский... пероксинитрита выпячивания мембраны растут в размере, их число вырастает (рис. 1, в), дискоидная форма перебегает в округлую либо сферическую. Наблюдаются выпячивания различного размера, и они неравномерно распределены по поверхности мембраны УДК 616.155.13: 612.127.4 - В. В. Аничкин (Гомель) А. Н. Лызиков (Гомель) > М. Е. Абраменко (Гомель) Х. Х. Лавинский.... Подобные особенности формы свойственны для акантоцита [3].




Рис. 1. Формы эритроцитов (сканирующая электрическая микроскопия, ув. 5000).

На рисунке (а) представлены эритроциты контрольного эталона, на рисунках (б) и (в) — эритроциты крови, обработанной 2 mM пероксинитритом




Рис. 2. Эритроциты крови, обработанной 2 mM пероксинитритом

(сканирующая УДК 616.155.13: 612.127.4 - В. В. Аничкин (Гомель) А. Н. Лызиков (Гомель) > М. Е. Абраменко (Гомель) Х. Х. Лавинский... электрическая микроскопия, ув. 1000).






Рис. 3. Трехмерное изображение участков мембраны эритроцита с наложенным

пространственным рассредотачиванием угла вращения консоли (атомно-силовая микроскопия).

Черные области соответствуют областям с более жесткими участками мембраны.

На рисунке (а) представлен УДК 616.155.13: 612.127.4 - В. В. Аничкин (Гомель) А. Н. Лызиков (Гомель) > М. Е. Абраменко (Гомель) Х. Х. Лавинский... участок мембраны эритроцита из контрольных образцов,

а на рисунке (б) — участок мембраны эритроцита крови, обработанной 2,5 мМ пероксинитритом.

Не так давно итальянскими учеными было найдено образование (до 40% от общего числа клеток) схожей УДК 616.155.13: 612.127.4 - В. В. Аничкин (Гомель) А. Н. Лызиков (Гомель) > М. Е. Абраменко (Гомель) Х. Х. Лавинский... формы эритроцита (акантоцита) при обработке суспензии эритроцитов 50 µМ пероксинитритом и показано, что в схожих выростах накапливаются такие белки эритроцитарной мембраны, как белок полосы 3 и спектрин [10]. В наших опытах (при использовании цельной крови УДК 616.155.13: 612.127.4 - В. В. Аничкин (Гомель) А. Н. Лызиков (Гомель) > М. Е. Абраменко (Гомель) Х. Х. Лавинский...) количество акантоцитов было меньше 40% от общего числа эритроцитов и росло с повышением концентрации пероксинитрита. Так, по данным световой микроскопии, в контрольных образчиках и в крови, обработанной 300 М и 2 mM пероксинитритом, процентное УДК 616.155.13: 612.127.4 - В. В. Аничкин (Гомель) А. Н. Лызиков (Гомель) > М. Е. Абраменко (Гомель) Х. Х. Лавинский... соотношение акантоцитов и общего числа эритроцитов в крови было 1,0±0,8%, 7,4±4,0% (р=0,009), 22,0±12,0% (р=0,01). При больших концентрациях пероксинитрита наблюдается также рост числа сфероцитов.

^ Реорганизация мембраны эритроцитов при обработке цельной крови пероксинитритом

По данным атомно-силовой микроскопии после обработки УДК 616.155.13: 612.127.4 - В. В. Аничкин (Гомель) А. Н. Лызиков (Гомель) > М. Е. Абраменко (Гомель) Х. Х. Лавинский... крови пероксинитритом наблюдается реорганизация структуры мембраны эритроцита — возникают микрообласти с завышенной жесткостью (рис. 3). Модуль Юнга мембран эритроцитов, фиксированных 1% глютаровым альдегидом, для контрольных образцов приравнивался 18,77,5 МПа (n=8), а для не нормальных областей УДК 616.155.13: 612.127.4 - В. В. Аничкин (Гомель) А. Н. Лызиков (Гомель) > М. Е. Абраменко (Гомель) Х. Х. Лавинский..., обработанных пероксинитритом эритроцитов, — 29,2  2,6 МПа (р0,001, n=6).

^ Фазовое разделение липидов и изменение формы эритроцитов

Форма эритроцита определяется 2-мя компонентами его мембраны — липидным бислоем с включенными в него белками и цитоскелетом. Пероксинитрит, как надо из литературных УДК 616.155.13: 612.127.4 - В. В. Аничкин (Гомель) А. Н. Лызиков (Гомель) > М. Е. Абраменко (Гомель) Х. Х. Лавинский... данных, реагирует с молекулами обеих компонент мембраны [8, 9, 10, 12, 13]. Пероксинитрит в концентрации 300 µM вызывает 50% агрегацию молекул спектрина в буферном растворе [7]. В суспензии эритроцитов в буферном растворе при действии 50 µM пероксинитрита наблюдается также скопление УДК 616.155.13: 612.127.4 - В. В. Аничкин (Гомель) А. Н. Лызиков (Гомель) > М. Е. Абраменко (Гомель) Х. Х. Лавинский... спектрина в местах выпячиваний мембраны [10]. По нашим данным, пероксинитрит в больших концентрациях в цельной крови вызывает сфероцитоз. Сфероцитоз, как понятно, наблюдается при денатурации спектрина (к примеру, вызванной повышением температуры среды до 49–50°С). Таким макаром УДК 616.155.13: 612.127.4 - В. В. Аничкин (Гомель) А. Н. Лызиков (Гомель) > М. Е. Абраменко (Гомель) Х. Х. Лавинский..., спектрин, как компонент цитоскелета, играет важную роль в пероксинитрит-индуцированных конфигурациях формы эритроцита. Агрегация спектрина и скопление его в местах выпячиваний мембраны были исследованы в модельных системах. В цельной крови часть УДК 616.155.13: 612.127.4 - В. В. Аничкин (Гомель) А. Н. Лызиков (Гомель) > М. Е. Абраменко (Гомель) Х. Х. Лавинский... пероксинитрита расходуется в реакциях с молекулярными компонентами плазмы, также с другими клеточками крови. В наших опытах концентрация пероксинитрита, реагирующего с эритроцитами (как следует, и со спектрином эритроцитов), меньше, чем рассчитанная для цельной крови УДК 616.155.13: 612.127.4 - В. В. Аничкин (Гомель) А. Н. Лызиков (Гомель) > М. Е. Абраменко (Гомель) Х. Х. Лавинский.... Потому вклад спектринового компонента в процессы конфигурации формы эритроцита при действии пероксинитрита миниатюризируется. Мы полагаем, что пероксинитрит - индуцированная трансформация формы эритроцита может быть также обоснована переменами в липидном бислое мембраны эритроцита УДК 616.155.13: 612.127.4 - В. В. Аничкин (Гомель) А. Н. Лызиков (Гомель) > М. Е. Абраменко (Гомель) Х. Х. Лавинский.... Из анализа данных, приобретенных способами атомно-силовой микроскопии, следует, что пероксинитрит вызывает фазовое разделение липидов в итоге их перекисного окисления уже при концентрации 300 µМ в цельной крови. Образуются домены разной толщины мембраны с УДК 616.155.13: 612.127.4 - В. В. Аничкин (Гомель) А. Н. Лызиков (Гомель) > М. Е. Абраменко (Гомель) Х. Х. Лавинский... разным липидным составом и механическими качествами. Благодаря образованию доменов, в состав которых входят липиды или с насыщенными, или ненасыщенными жирными кислотами, происходит перераспределение белков мембраны. Некие белки исключаются из определенных липидных УДК 616.155.13: 612.127.4 - В. В. Аничкин (Гомель) А. Н. Лызиков (Гомель) > М. Е. Абраменко (Гомель) Х. Х. Лавинский... доменов, другие, напротив, врубаются в их состав. Липиды с хвостами из ненасыщенных и насыщенных жирных кислот различаются по пространственной конфигурации [11, 14]. Потому образование доменов с разным липидным составом приводит к изменению топографии участков УДК 616.155.13: 612.127.4 - В. В. Аничкин (Гомель) А. Н. Лызиков (Гомель) > М. Е. Абраменко (Гомель) Х. Х. Лавинский... поверхности эритроцита. Конкретно искривление мономолекулярного слоя билипидной мембраны считается предпосылкой образования акантоцитов при разных заболеваниях, обусловленных переменами в липидном составе, связанных, в главном, с увеличением содержания холестерола [3, 4, 5]. В рассматриваемом случае пероксинитрит вызывает УДК 616.155.13: 612.127.4 - В. В. Аничкин (Гомель) А. Н. Лызиков (Гомель) > М. Е. Абраменко (Гомель) Х. Х. Лавинский... образование микрообластей с разным липидным составом, что приводит к вспучиванию мембраны в разных местах эритроцита.

Заключение

На базе анализа данных световой, сканирующей электрической и атомно - силовой микроскопии предлагаются механизмы, ответственные за индуцированный активными УДК 616.155.13: 612.127.4 - В. В. Аничкин (Гомель) А. Н. Лызиков (Гомель) > М. Е. Абраменко (Гомель) Х. Х. Лавинский... формами азота пойкилозитоз в цельной крови человека. Первичными механизмами конфигурации формы эритроцита при действии активных форм азота является фазовое разделение липидов в итоге перекисного окисления липидов и агрегация спектрина, следствием которых УДК 616.155.13: 612.127.4 - В. В. Аничкин (Гомель) А. Н. Лызиков (Гомель) > М. Е. Абраменко (Гомель) Х. Х. Лавинский... является акантоцитоз.

ЛИТЕРАТУРА

  1. Стародубцева М.Н., Черенкевич С.Н. Механизмы реакций гемоглобина с пероксинитритом в водно-солевом растворе // Весці НАН Беларусі (News of Biomedical Sciences). — 2003. — № 2. — С. 86–90.

  2. Стародубцева М.Н. Двоякая роль пероксинитрита УДК 616.155.13: 612.127.4 - В. В. Аничкин (Гомель) А. Н. Лызиков (Гомель) > М. Е. Абраменко (Гомель) Х. Х. Лавинский... в организме // Трудности здоровья и экологии. — 2004. — № 1. — С. 35–41.

  3. Шиффман Ф.Дж. Патофизиология крови // СПб., 2001. — С. 78–81.

  4. Danek A., Walker R.H. Neuroacanthocytosis // Curr. Opin. Neurol. — 2005. — Vol. 18, № 4. — Р. 386–392.

  5. De Franceschi L., Olivieri O., Corrocher R. Erythrocyte aging in УДК 616.155.13: 612.127.4 - В. В. Аничкин (Гомель) А. Н. Лызиков (Гомель) > М. Е. Абраменко (Гомель) Х. Х. Лавинский... neurodegenerative disorders // Cell. Mol. Biol. — 2004. — Vol. 50, № 2. — Р. 179–185.

  6. Denicola A., Radi R. Peroxynitrite and drug-dependent toxicity // Toxicolog. — 2005. — Vol. 208, № 2. — Р. 273–288.

  7. Mascio P. Di., Dewez B., Garcia C.R.S. Ghost protein damage УДК 616.155.13: 612.127.4 - В. В. Аничкин (Гомель) А. Н. Лызиков (Гомель) > М. Е. Абраменко (Гомель) Х. Х. Лавинский... by peroxynitrite and its protection by melatonin // Braz. J. Med. Biol. Research. — 2000. — Vol. 33. — Р. 11–17.

  8. Ebadi M., Sharma S.K., Ghafourifar P., Brown-Borg H., ReFaey H.E. Peroxynitrite in pathogenesis of Parkinson’s УДК 616.155.13: 612.127.4 - В. В. Аничкин (Гомель) А. Н. Лызиков (Гомель) > М. Е. Абраменко (Гомель) Х. Х. Лавинский... disease and the neuroprotective role of metallothioneins // Method Enzymol. — 2005. — Vol. 396. — Р. 276–297.

  9. Frein D., Schildknecht S., Bachschmid M., Ullrich V. Redox regulation: a new challenge for pharmacology // Biochemical Pharmacology. — 2005. — Vol. 70. — Р УДК 616.155.13: 612.127.4 - В. В. Аничкин (Гомель) А. Н. Лызиков (Гомель) > М. Е. Абраменко (Гомель) Х. Х. Лавинский.... 811–823.

  10. Matarrese P., Straface E., Pietraforte D., Gambardella L., Vona R., Maccaglia A., Minetti M., and Malorni W. Peroxynitrite induces senescence and apoptosis of red blood cells through the activation of aspartyl УДК 616.155.13: 612.127.4 - В. В. Аничкин (Гомель) А. Н. Лызиков (Гомель) > М. Е. Абраменко (Гомель) Х. Х. Лавинский... and cysteinyl proteases // FASEB J. — 2005. — Vol. 19, № 3. — Р. 416–418.

  11. Membrane dynamics and domains. In: Sub-cellular biochemistry. Ed. P.J. Quinn. Kluwer Academic. Plenum Publishers. — New York, 2004. — 500 p.

  12. Pryor W.A., Squadrito G.L. The chemistry УДК 616.155.13: 612.127.4 - В. В. Аничкин (Гомель) А. Н. Лызиков (Гомель) > М. Е. Абраменко (Гомель) Х. Х. Лавинский... of peroxynitrite: a product from the reaction of nitrite with superoxide // American Journal of Physiology. — 1995. — Vol. 268, № 5. — Р. 699–722.

  13. Radi R., Beckman J.S., Bush K.M., Freeman B.A. Peroxynitrite-induced УДК 616.155.13: 612.127.4 - В. В. Аничкин (Гомель) А. Н. Лызиков (Гомель) > М. Е. Абраменко (Гомель) Х. Х. Лавинский... membrane lipid peroxidation: the cytotoxic potential of superoxide and nitric oxide // Arch Biochem Biophys. — 1991. — Vol. 288, № 2. — Р. 481–487.

  14. Red cell membrane transport in health and disease. Eds.: Ingolf Bernhart // J Clive Ellory, Stringer. — London. 2003. —748 p.

  15. Robinson K УДК 616.155.13: 612.127.4 - В. В. Аничкин (Гомель) А. Н. Лызиков (Гомель) > М. Е. Абраменко (Гомель) Х. Х. Лавинский....M., Beckman J.S. Synthesis of peroxynitrite from nitrite and hydrogen peroxide // Method Enzymol. — 2005. — Vol. 396. — Р. 207–214.

Поступила 02.03.2006

УДК: 611.438-013:591.443

^ РАЗВИТИЕ ВИЛОЧКОВОЙ ЖЕЛЕЗЫ Белоснежной КРЫСЫ

В ПРЕНАТАЛЬНОМ ОНТОГЕНЕЗЕ

П.Г. Пивченко, А.А. Пасюк

Белорусский муниципальный УДК 616.155.13: 612.127.4 - В. В. Аничкин (Гомель) А. Н. Лызиков (Гомель) > М. Е. Абраменко (Гомель) Х. Х. Лавинский... мед институт

На сериях срезов зародышей и плодов белоснежной крысы определены источники развития вилочковой железы. Установлены главные этапы гистогенеза, определены морфометрические характеристики тимуса в разные сроки эмбриогенеза. Проанализирована динамика конфигурации морфометрических черт и УДК 616.155.13: 612.127.4 - В. В. Аничкин (Гомель) А. Н. Лызиков (Гомель) > М. Е. Абраменко (Гомель) Х. Х. Лавинский... выявлены критичные периоды развития тимуса.

Ключевики: белоснежная крыса, тимус, эмбриогенез, вилочковая железа, гистогенез.

^ DEVELOPMENT OF THE THYMUS OF A WHITE RAT

IN PRENATAL ONTOGENESIS

P.G. Pivtchenko. A.A.Pasiuk

Belarusian State Medical УДК 616.155.13: 612.127.4 - В. В. Аничкин (Гомель) А. Н. Лызиков (Гомель) > М. Е. Абраменко (Гомель) Х. Х. Лавинский... University

On series of cuts of embryos and fetals of a white rat there are determined sources of development of the thymus. The basic stages histogenesis are allocated, determined morphometrical parameters thymus in various terms of УДК 616.155.13: 612.127.4 - В. В. Аничкин (Гомель) А. Н. Лызиков (Гомель) > М. Е. Абраменко (Гомель) Х. Х. Лавинский... embryogenesis. Dynamics of morphometrical parameters change is analyzed and the critical periods of the thymus development are determined.

^ Key words: white rat, thymus, embryogenesis, thymus gland, histogenezis.



Введение

Вилочковая железа, как центральный УДК 616.155.13: 612.127.4 - В. В. Аничкин (Гомель) А. Н. Лызиков (Гомель) > М. Е. Абраменко (Гомель) Х. Х. Лавинский... орган иммунной системы, повсевременно находится в поле зрения исследователей при исследовании последствий воздействия разных неблагоприятных причин среды. Обычно, подобные опыты проводятся на белоснежной крысе, которая является одним из более доступных лабораторных животных. Для УДК 616.155.13: 612.127.4 - В. В. Аничкин (Гомель) А. Н. Лызиков (Гомель) > М. Е. Абраменко (Гомель) Х. Х. Лавинский... беспристрастной оценки получаемых данных следует знать закономерности развития и варианты обычного строения вилочковой железы у белоснежной крысы. В литературных источниках рассматривается несколько концепций гистогенеза эпителиальной закладки вилочковой железы. Ряд создателей УДК 616.155.13: 612.127.4 - В. В. Аничкин (Гомель) А. Н. Лызиков (Гомель) > М. Е. Абраменко (Гомель) Х. Х. Лавинский... рассматривают гистогенез эпителиальной закладки тимуса из энтодермы вентрального отдела третьих глоточных кармашков [1]. Другие исследователи считают, что эпителиальный зачаток тимуса имеет смешанное экто-энтодермальное происхождение, которое заключается в слиянии цервикального пузырька эктодермального происхождения УДК 616.155.13: 612.127.4 - В. В. Аничкин (Гомель) А. Н. Лызиков (Гомель) > М. Е. Абраменко (Гомель) Х. Х. Лавинский... и выпячивании энтодермы третьего глоточного кармашка (рис. 1) [3]. Большая часть исследователей выделяют в развитии структур вилочковой железы у белоснежной крысы ряд главных стадий:1 — эпителиального зачатка, 2 — заселение зачатка лимфоцитами, 3 — образование долек, 4 — дифференцировка на кору УДК 616.155.13: 612.127.4 - В. В. Аничкин (Гомель) А. Н. Лызиков (Гомель) > М. Е. Абраменко (Гомель) Х. Х. Лавинский... и мозговое вещество. При всем этом имеется некое несоответствие в сроках прохождения этих стадий [2, 4, 5]. Фактически отсутствуют материалы, характеризующие темп развития отдельных структур, а имеются фрагментарные свойства пролиферативной активности для органа в целом [2]. В УДК 616.155.13: 612.127.4 - В. В. Аничкин (Гомель) А. Н. Лызиков (Гомель) > М. Е. Абраменко (Гомель) Х. Х. Лавинский... связи с этим нами поставлена цель: установить источники и закономерности эмбриогенеза вилочковой железы белоснежной крысы.




Рис. 1. Схема развития закладки тимуса (В.П. Харченко, Д.С. Саркисов и др.; 1998).



Материалы и способы

Исследована УДК 616.155.13: 612.127.4 - В. В. Аничкин (Гомель) А. Н. Лызиков (Гомель) > М. Е. Абраменко (Гомель) Х. Х. Лавинский... 61 серия срезов эмбрионов, предплодов и плодов белоснежной крысы от 4 мм ТКД до 40 мм ТКД (с 10 по 21 день развития) из эмбриологической коллекции кафедры обычной анатомии БГМУ. Изучены источники развития, сроки закладки и этапы формирования УДК 616.155.13: 612.127.4 - В. В. Аничкин (Гомель) А. Н. Лызиков (Гомель) > М. Е. Абраменко (Гомель) Х. Х. Лавинский... толикой вилочковой железы. Измерялись длина, ширина, толщина толикой, также рассчитывался объем толикой по формуле вращения эллипса:

,

где V — объем толики, A — длина, B — ширина, C — толщина. Определялись средние морфометрические характеристики и УДК 616.155.13: 612.127.4 - В. В. Аничкин (Гомель) А. Н. Лызиков (Гомель) > М. Е. Абраменко (Гомель) Х. Х. Лавинский... проводилась статистическая обработка. Для анализа конфигурации морфометрических характеристик рассчитывались темп роста, темп прироста, константа роста и удельная скорость роста.

Результаты и обсуждение

В итоге исследования установлено, что в первый раз выявляется энтодермальная закладка тимуса УДК 616.155.13: 612.127.4 - В. В. Аничкин (Гомель) А. Н. Лызиков (Гомель) > М. Е. Абраменко (Гомель) Х. Х. Лавинский... на 10 день эмбриогенеза (эмбрионы 4 мм ТКД). Она представлена скоплением энтодермальных клеток вентролатерального отдела стены третьих глоточных кармашков в виде их утолщения (рис. 2). На 12 день из углубления третьей глоточной щели цервикального УДК 616.155.13: 612.127.4 - В. В. Аничкин (Гомель) А. Н. Лызиков (Гомель) > М. Е. Абраменко (Гомель) Х. Х. Лавинский... синуса напротив энтодермальной закладки отделяется сгущение эктодермальных клеток — цервикальный пузырек (рис. 3). На 13 день эмбриогенеза энто- и эктодермальные сгущения соединяются , образуя закладку толикой органа.




Рис. 2. Зародыш белоснежной крысы 5 мм ТКД

1 — энтодермальная закладка тимуса, 2 — глоточный кармашек, 3 — полость УДК 616.155.13: 612.127.4 - В. В. Аничкин (Гомель) А. Н. Лызиков (Гомель) > М. Е. Абраменко (Гомель) Х. Х. Лавинский... глотки.

Расцветка по Бильшовскому-Буке. Микрофотография. Повышение ×100.



Рис. 3. Зародыш крысы 8мм ТКД.

1 — цервикальный пузырек, 2 — цервикальный синус.

Расцветка по Бильшовскому-Буке. Микрофотография. Повышение ×200.



Последние вырастают в каудальном направлении, растут в размерах; на 14 день они УДК 616.155.13: 612.127.4 - В. В. Аничкин (Гомель) А. Н. Лызиков (Гомель) > М. Е. Абраменко (Гомель) Х. Х. Лавинский... теряют связь с глоточными кармашками и опускаются за грудину, сближаясь вместе. На 15 день внедряется мезенхима и сосуды (рис. 4). На 18 день определяется деление паренхимы на корковое и мозговое вещество. К 20 суткам эмбриогенеза УДК 616.155.13: 612.127.4 - В. В. Аничкин (Гомель) А. Н. Лызиков (Гомель) > М. Е. Абраменко (Гомель) Х. Х. Лавинский... вилочковая железа по наружным признакам имеет дефинитивный вид. Она представлена 2-мя соприкасающимися медиальными поверхностями, пирамидальными толиками, окруженными общей капсулой. Толики размещены в вентральном средостении: каудальный полюс добивается уровня каудального края второго ребра, краниальный УДК 616.155.13: 612.127.4 - В. В. Аничкин (Гомель) А. Н. Лызиков (Гомель) > М. Е. Абраменко (Гомель) Х. Х. Лавинский... — находится на уровне краниального края грудины. Дорсально к толикам тимуса прилежат: трахея, общие сонные артерии, аорта; дорсо-латерально — внутренние яремные вены и блуждающие нервишки; вентрально-подподъязычные мускулы и их фасции.

Конфигурации УДК 616.155.13: 612.127.4 - В. В. Аничкин (Гомель) А. Н. Лызиков (Гомель) > М. Е. Абраменко (Гомель) Х. Х. Лавинский... динамики морфометрических характеристик тимуса зародышей белоснежной крысы до рождения приведены в таблице 1.



Рис. 4. Зародыш крысы 11 мм ТКД.

1 — закладка тимуса, 2 — врастающие сосуды и мезенхима.

Расцветка гематоксилин-эозин. Микрофотография. Повышение ×100.


^ Таблица 1

Морфометрические свойства УДК 616.155.13: 612.127.4 - В. В. Аничкин (Гомель) А. Н. Лызиков (Гомель) > М. Е. Абраменко (Гомель) Х. Х. Лавинский... толикой тимуса

Возраст

(день)

Длина

правой толики

(мкм)

Толщина

правой толики

(мкм)

Ширина

правой толики

(мкм)

Длина

левой толики

(мкм)

Толщина

левой толики

(мкм)

Ширина

левой толики

(мкм)

14

367,63±36,08

148,30±19,44

285,64±3,80

385,81±7,77

166,15±7,27

287,37±8,80

15

380,23±32,24

170,60±17,06

299,02±8,08

414,54±20,55

200,88±25,87

292,47±18,31

16

693,43±23,91

462,71±29,73

495,74±52,21

841,98±15,51

490,33±31,95

415,34±27,03

17

939,66±100,08

524,87±27,96

597,15±27,03

1101,15±123,20

603,24±27,34

543,80±21,08

18

1380,13±35,36

560,05±16,56

671,43±20,03

1376,60±20,97

795,20±64,42

623,45±16,23

19

1304,98±30,00

601,37±21,42

740,66±18,53

1407,14±7,40

577,05±8,33

602,23±33,51

20

1744,54±38,95

692,91±8,31

912,50±50,23

1780,38±38,00

649,93±18,41

864,00±34,44

21

1960,00±35,12

844,60±26,26

1293,26±66,49

1974,00±54,64

898,83±97,85

1266,68±28,05

22

2600,00±128,17

927,39±35,78

1782,66±45,96

2701,75±91,38

1046,89±97,50

1628,28±179,76




Из таблицы 1 следует, что линейные размеры толикой вилочковой железы растут от момента закладки до рождения с разной интенсивностью, при этом УДК 616.155.13: 612.127.4 - В. В. Аничкин (Гомель) А. Н. Лызиков (Гомель) > М. Е. Абраменко (Гомель) Х. Х. Лавинский... длина повсевременно преобладает над остальными линейными размерами. Ширина и толщина до 18 суток эмбриогенеза примерно схожи, а в следующем толики тимуса растут значительнее в поперечном направлении и ширина начинает преобладать над УДК 616.155.13: 612.127.4 - В. В. Аничкин (Гомель) А. Н. Лызиков (Гомель) > М. Е. Абраменко (Гомель) Х. Х. Лавинский... шириной. Вышеупомянутое наглядно продемонстрировано на графике (рис. 5). При анализе темпа роста отдельных морфометрических черт установлено, что для всех измеряемых линейных характеристик толикой тимуса имеет место период ускоренного роста на 16 день эмбриогенеза (рис. 6). Периоды ускоренного УДК 616.155.13: 612.127.4 - В. В. Аничкин (Гомель) А. Н. Лызиков (Гомель) > М. Е. Абраменко (Гомель) Х. Х. Лавинский... роста для длины толикой приходится на 18 и 20 день, а для ширины и толщины — на 21 день эмбриогенеза, при этом темп роста ширины толикой преобладает над темпом роста толщины.



Рис. 5. Размеры толикой УДК 616.155.13: 612.127.4 - В. В. Аничкин (Гомель) А. Н. Лызиков (Гомель) > М. Е. Абраменко (Гомель) Х. Х. Лавинский... тимуса





Рис. 6. Темп роста морфометрических черт толикой


При анализе константы роста установлено, что периоды ускоренного роста подобны периодам, выявленным при анализе темпа роста. Таким макаром, период ускоренного роста для длины толикой приходится на УДК 616.155.13: 612.127.4 - В. В. Аничкин (Гомель) А. Н. Лызиков (Гомель) > М. Е. Абраменко (Гомель) Х. Х. Лавинский... 16, 18 и 20 день; для ширины и толщины — на 16, 21 и 22 день. Период замедленного роста приходится на 17 и 19 день.

Для интегральной оценки конфигурации всех морфометрических характеристик рассчитывался средний объем толикой тимуса (табл. 2). Для большей наглядности данные представлены на УДК 616.155.13: 612.127.4 - В. В. Аничкин (Гомель) А. Н. Лызиков (Гомель) > М. Е. Абраменко (Гомель) Х. Х. Лавинский... графике (рис. 7). Установлено, что за период внутриутробного развития объем толикой тимуса возрастает примерно в 250 раз.

^ Таблица 2

Объем толикой тимуса

Возраст (день)

Объем правой толики (мм3)

Объем левой толики (мм3)

14

0,07±0,0017

0,08±0,0026

15

0,08±0,0018

0,10±0,0041

16

0,67±0,0016

0,72±0,0064

17

1,23±0,032

1,51±0,021

18

2,17± 0,049

2,86±0,090

19

2,43±0,0053

2,43±0,0057

20

4,62±0,0071

4,19±0,0012

21

8,96±0,025

9,41±0,062

22

17,99±0,088

19,28±0,067




^ Рис. 7. Динамика конфигураций УДК 616.155.13: 612.127.4 - В. В. Аничкин (Гомель) А. Н. Лызиков (Гомель) > М. Е. Абраменко (Гомель) Х. Х. Лавинский... объема тимуса



Выводы

При анализе процента прироста объема толикой тимуса (рис. 8) установлено, что максимум прироста приходится на 16 день эмбриогенеза. При анализе константы роста объема толикой тимуса (рис. 9) определяется два периода ускоренного роста: 1-ый период приходиться УДК 616.155.13: 612.127.4 - В. В. Аничкин (Гомель) А. Н. Лызиков (Гомель) > М. Е. Абраменко (Гомель) Х. Х. Лавинский... на 16 день эмбриогенеза, 2-ой — начинается с 20 суток и добивается максимума к рождению. Период замедленного роста выявляется на 17–19 день эмбриогенеза.




Рис. 8. Процент прироста объема толикой тимуса



Рис. 9. Константа роста морфометрических характеристик тимуса



На УДК 616.155.13: 612.127.4 - В. В. Аничкин (Гомель) А. Н. Лызиков (Гомель) > М. Е. Абраменко (Гомель) Х. Х. Лавинский... 15 день в закладку врастает мезенхима с первыми сосудами и в ней возникают 1-ые лимфоциты. По всей видимости, конкретно с васкуляризацией органа связан 1-ый период ускоренного роста. Количество лимфоцитов возрастает и на 18 день эмбриогенеза формируется УДК 616.155.13: 612.127.4 - В. В. Аничкин (Гомель) А. Н. Лызиков (Гомель) > М. Е. Абраменко (Гомель) Х. Х. Лавинский... разделение паренхимы тимуса на корковое и мозговое вещество. И соответственно, эта высококачественная перестройка приходится на период замедленного роста. 2-ой период ускоренного роста, может быть, подготавливает орган к постнатальному контакту организма с экзогенными УДК 616.155.13: 612.127.4 - В. В. Аничкин (Гомель) А. Н. Лызиков (Гомель) > М. Е. Абраменко (Гомель) Х. Х. Лавинский... антигенами.

Заключение

Таким макаром, в итоге проведенных исследовательских работ определены источники и сроки закладки тимуса, также установлены главные этапы его развития и выявлены критичные периоды его развития.

ЛИТЕРАТУРА

  1. Алешин В.Б УДК 616.155.13: 612.127.4 - В. В. Аничкин (Гомель) А. Н. Лызиков (Гомель) > М. Е. Абраменко (Гомель) Х. Х. Лавинский...., Самулева С.В., Загуровский В.М., Тур М.И. Воздействие тропных гормонов гипофиза на брахиогенную группу желез и центральные органы иммунитета в пре- и постнатальном онтогенезе зайчика и крысы // Животрепещущие препядствия развития человека УДК 616.155.13: 612.127.4 - В. В. Аничкин (Гомель) А. Н. Лызиков (Гомель) > М. Е. Абраменко (Гомель) Х. Х. Лавинский... и млекопитающего. — Тр. Крымского мед института. — Симферополь, 1983. — С. 69–70.

  2. Долгова М.А., Марцинкевич Л.Ц., Батюто Т.Д., Титова Г.Н., Мясникова Т.И. Антенатальное и преждевременное постнатальное развитие органов иммуногенеза // Архив анатомии УДК 616.155.13: 612.127.4 - В. В. Аничкин (Гомель) А. Н. Лызиков (Гомель) > М. Е. Абраменко (Гомель) Х. Х. Лавинский..., гистологии и эмбриологии. — 1982. — № 2. — С. 73–83.

  3. Кемилева З. Вилочковая железа; под ред. д-ра мед. наук, проф. Р.М. Хаитова) — София: Медицина и физическая культура, 1979. — пер. с болгарского. — М.: Медицина, 1984. — С. 138.

  4. Петрова Т УДК 616.155.13: 612.127.4 - В. В. Аничкин (Гомель) А. Н. Лызиков (Гомель) > М. Е. Абраменко (Гомель) Х. Х. Лавинский....Б. Особенности строения вилочковой железы в антенатальном и ранешном постнатальном периодах онтогенеза при воздействии тетрациклина // Архив анатомии, гистологии и эмбриологии. — 1984. — № 2. — С. 85–92.

  5. Петрова Т.Б. Развитие тимуса крыс в норме и при действии лекарств // Животрепещущие УДК 616.155.13: 612.127.4 - В. В. Аничкин (Гомель) А. Н. Лызиков (Гомель) > М. Е. Абраменко (Гомель) Х. Х. Лавинский... трудности развития человека и млекопитающего — Тр. Крымского мед института. — Симферополь, 1983. — С. 177–179.



Поступила 16.03.2006


^ Мед Нюансы ЧЕРНОБЫЛЬСКОЙ КАТАСТРОФЫ



МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ Нюансы ИОНИЗИРУЮЩЕГО ИЗЛУЧЕНИЯ
УДК 599.731.1:574.2
Рассредотачивание 137Cs по органам и тканям одичавших кабанов,

обитающих на УДК 616.155.13: 612.127.4 - В. В. Аничкин (Гомель) А. Н. Лызиков (Гомель) > М. Е. Абраменко (Гомель) Х. Х. Лавинский... местности Государственного парка «Припятский»

А.В. Углянец, В.П. Кудряшов, Н.Н. Бажанова, Р.А. Повелитель, В.А. Бажанов

Государственный парк «Припятский», г. Туров

^ Институт радиобиологии НАН Беларуси

Представлены данные содержания радионуклидов в почве и органах одичавших животных УДК 616.155.13: 612.127.4 - В. В. Аничкин (Гомель) А. Н. Лызиков (Гомель) > М. Е. Абраменко (Гомель) Х. Х. Лавинский..., обитающих в Государственном парке «Припятский», которые являются основой для более детализированных исследовательских работ уровней содержания радионуклидов в разных компонентах экосистемы заповедника с целью развития разных видов туризма и хозяйственной деятельности УДК 616.155.13: 612.127.4 - В. В. Аничкин (Гомель) А. Н. Лызиков (Гомель) > М. Е. Абраменко (Гомель) Х. Х. Лавинский....

^ Ключевики: Гамма-спектрометрия, цезий-137, Государственный парк «Припятский», одичавший кабан, органы и ткани.

Distribution 137Cs on bodies and tissues of wild piqs

which inhabit the territory of National park «Pripyatsky»

A.V. Uglyanets УДК 616.155.13: 612.127.4 - В. В. Аничкин (Гомель) А. Н. Лызиков (Гомель) > М. Е. Абраменко (Гомель) Х. Х. Лавинский..., V.P. Kudrjashov, N.N. Bashanova, R.A. Korol, V.A. Bashanov

National Park «Pripyatsky», Turov

Institute of radiobiology of a National Academy of sciences of Belarus

The results of radionuclides contents in soil, organs and tissues УДК 616.155.13: 612.127.4 - В. В. Аничкин (Гомель) А. Н. Лызиков (Гомель) > М. Е. Абраменко (Гомель) Х. Х. Лавинский... of wild animals which inhabit the territory of National Park «Pripyatsky» are presented. These results are a basis for more details research of the levels of radionuclides contamination of the different components УДК 616.155.13: 612.127.4 - В. В. Аничкин (Гомель) А. Н. Лызиков (Гомель) > М. Е. Абраменко (Гомель) Х. Х. Лавинский... of the ecosystem of National Park for future development of tourism and economic activity.

^ Key words: Gamma-spectrometry, cesium-137, National Park «Pripyatsky», organs and tissues, wild pig.


ugolovnaya-otvetstvennost-za-ekologicheskie-prestupleniya.html
ugolovnaya-otvetstvennost-za-narushenie-zemelnogo-zakonodatelstva.html
ugolovnaya-otvetstvennost-za-prestupleniya-sovershennie-s-dvumya-formami-vini-po-ugolovnomu-pravu-rossii-i-italii.html